Microscopie à fluorescence

L'éclairage et l'observation par fluorescence constituent la technique de microscopie professionnelle la plus employée aujourd'hui, à la fois dans les sciences médicales et biologiques, ce qui a encouragé le développement de microscopes plus sophistiqués et de nombreux accessoires de fluorescence. L'épi-fluorescence, ou fluorescence incidente, est devenue la méthode de choix dans de nombreuses applications et constitue une grande partie de ce tutoriel. Nous avons divisé la section de fluorescence de l'amorce en plusieurs catégories afin de faciliter son organisation et son téléchargement. Veuillez suivre les liens ci-dessous pour accéder aux points d'intérêt.

* Concepts de base: La fluorescence fait partie de la famille de processus de luminescence omniprésente dans laquelle les molécules sensibles émettent de la lumière provenant d'états électroniquement excités créés par un mécanisme physique (absorption de la lumière, par exemple), mécanique (friction) ou chimique. La génération de luminescence par excitation d'une molécule par des photons de lumière ultraviolette ou visible est un phénomène appelé photoluminescence, divisé formellement en deux catégories: fluorescence et phosphorescence, en fonction de la configuration électronique de l'état excité et de la voie d'émission. La fluorescence est la propriété de certains atomes et molécules d'absorber la lumière à une longueur d'onde particulière et d'émettre ensuite une lumière de longueur d'onde plus longue après un bref intervalle, appelée durée de vie de la fluorescence. Le processus de phosphorescence se produit d'une manière similaire à la fluorescence, mais avec une durée de vie à l'état excité beaucoup plus longue.

* Aspects fondamentaux de la microscopie à fluorescence: Le microscope à fluorescence moderne combine la puissance des composants optiques haute performance avec le contrôle informatisé de l'instrument et l'acquisition d'images numériques pour atteindre un niveau de sophistication bien supérieur à l'observation humaine. La microscopie dépend maintenant beaucoup de l’imagerie électronique pour acquérir rapidement des informations à des niveaux de lumière faibles ou à des longueurs d’onde non détectables, comme indiqué dans cet article de Nikon MicroscopyU. Ces améliorations techniques ne sont pas de simples vitrages, mais des composants essentiels du microscope optique en tant que système.

* Anatomie du microscope à fluorescence: Contrairement aux autres modes de microscopie optique basés sur des caractéristiques d'échantillons macroscopiques, tels que les gradients de phase, l'absorption lumineuse et la biréfringence, la microscopie à fluorescence est capable d'imager la distribution d'une seule espèce moléculaire uniquement propriétés de l'émission de fluorescence. Ainsi, en utilisant la microscopie à fluorescence, la localisation précise des composants intracellulaires marqués avec des fluorophores spécifiques peut être surveillée, ainsi que leurs coefficients de diffusion associés, leurs caractéristiques de transport et leurs interactions avec d'autres biomolécules. En outre, la réponse spectaculaire de la fluorescence aux variables environnementales localisées permet d'étudier le pH, la viscosité, l'indice de réfraction, les concentrations ioniques, le potentiel de membrane et la polarité du solvant dans les cellules et les tissus vivants.

* Aspects pratiques des combinaisons de filtres de fluorescence: Les fabricants de microscopes proposent des combinaisons de filtres propriétaires (souvent appelés cubes ou blocs) contenant une combinaison de miroirs dichroïques et de filtres capables d'exciter les chromophores fluorescents et de rediriger la fluorescence secondaire vers les oculaires ou les tubes. Un large éventail de cubes filtrants est disponible auprès de la plupart des grands fabricants, qui produisent désormais des ensembles de filtres capables d'imager la plupart des fluorophores courants utilisés aujourd'hui.

* Aperçu des sources de lumière pour la microscopie à fluorescence: Afin de générer une intensité lumineuse d'excitation suffisante pour fournir une émission de fluorescence secondaire capable d'être détectée, de puissantes sources lumineuses sont nécessaires. Ce sont généralement des lampes à arc au mercure ou au xénon (brûleur), qui produisent un éclairage à haute intensité suffisamment puissant pour reproduire des échantillons de fluorescence faiblement visibles.

* Sources de lumière pour la microscopie optique: Les performances des différentes sources d'éclairage disponibles pour la microscopie optique dépendent des caractéristiques d'émission et de la géométrie de la source, ainsi que de la distance focale, du grossissement et de l'ouverture numérique du système de lentilles de capteur. En évaluant l'adéquation d'une source lumineuse particulière, les paramètres importants sont la structure (la distribution spatiale de la lumière, la géométrie de la source, la cohérence et l'alignement), la distribution des longueurs d'onde, la stabilité spatiale et temporelle, la luminosité et être contrôlé.

* Mise au point et alignement des lampes à arc: Les lampes à arc au mercure et au xénon sont maintenant largement utilisées comme sources d'éclairage pour un grand nombre de recherches en microscopie à fluorescence à champ large. Les visiteurs peuvent se familiariser avec l'alignement et la focalisation de la lampe à arc dans un brûleur Mercury ou Xenon avec ce didacticiel interactif Nikon MicroscopyU, qui simule le réglage de la lampe dans un microscope à fluorescence.