Technologies de microscopie pour amateurs


Attributs minimum d'un microscope bas de gamme

De tous les instruments scientifiques, aucun n'a probablement plus de réflexion et de travail que son microscope optique.
L'amateur se trouve face à un marché pléthorique, s'il est facile d'éliminer les microscopes-jouets et ceux robustes mais de qualité très moyenne, ceux de marques ayant un catalogue pléthorique et un prix très élevé. A coté de cela on peut trouver des microscopes des quatres grandes marques, parfois moins chers et le plus souvent de bien meilleur qualité. Il y a aussi des microscopes de pays en voie de développement qui sont parfois (mais pas toujours) de bonne qualité.

Il faut aussi savoir que le grossissement réel d'un microscope est dix fois plus faible que celui affiché, une cellule prokariote n'est que de la taille d'un point! Pourtant quasiment tous les microscopes vendus en ligne affichent un grossissement allant jusqu'à 1000X. Or pour avoir ce niveau de grossissement, il faut en fait investir plus de 20 000 euros par exemple dans un Zeiss Axio Imager 2.
Avant d'engager un achat il serait donc bon de savoir qu'est-ce qu'on peut exiger d'un produit qui vaut plus de 1000 euros.
Microscope Motic BA210, LED, 4x-1000x, infinity, bino
Ceci est un très bon microscope à moins de 1 000 euros!

Principaux types de microscopes pour amateurs

* La microscopie à fond clair est la technique conventionnelle. Elle est adapté à l'observation des couleurs naturelles d'un échantillon ou à l'observation d'échantillons colorés. Le spécimen apparaît plus sombre sur un fond clair. Le problème principal avec ce type de microscope consiste en un faible contraste. Le traitement numérique d'image est la façon la plus simple d'y remédier, cependant certains filtres comme les filtres Rheinberg pour illuminateur ou des filtres polarisants sont assez attractifs. Un porte filtre est un minimum.

* La microscopie en fond noir montre les spécimens brillants sur un fond sombre. Les microscopes à champ clair dotés d'un condenseur avec un porte-filtre peuvent être facilement convertis en fond noir en plaçant un filtre d'arrêt dans le porte-filtre.

* La microscopie à contraste de phase nécessite des objectifs de contraste de phase spéciaux et un condenseur à contraste de phase spécial. Cette technique est utile pour observer des spécimens non colorés sans couleur (p. Ex. Bactéries). L'optique convertira les différences d'indice de réfraction de l'échantillon en différences de luminosité. Le contraste de phase produit des valeurs d'intensité d'image en fonction de l'ampleur de la longueur du trajet optique de l'échantillon, les zones très denses (celles ayant des longueurs de trajet importantes) apparaissant plus sombres que l'arrière-plan.

* La microscopie à contraste d'interférence différentielle (DIC) - Un excellent mécanisme pour rendre le contraste dans les échantillons transparents, la microscopie à contraste interférentiel différentiel (DIC) est un système d'interférence par cisaillement dans lequel le faisceau de référence est minuscule, généralement un peu moins que le diamètre d'un disque Airy . La technique produit une image monochromatique à ombre qui affiche efficacement le gradient des chemins optiques pour les fréquences spatiales hautes et basses présentes dans l'échantillon. Les régions de l'échantillon où les chemins optiques augmentent le long d'une direction de référence apparaissent plus claires (ou plus sombres), tandis que les régions où les différences de trajectoire diminuent apparaissent en contraste inversé. À mesure que le gradient de la différence de chemin optique augmente, le contraste de l'image augmente considérablement.

* La microscopie à polarisation produit également un spécimen brillant sur un fond sombre. Il peut également être facilement improvisé avec un microscope à fond clair. Un filtre polarisant est placé au-dessus de la lampe et un autre est placé entre la lame d’échantillon et l’objectif. Des parties de l'échantillon s'allumeront alors. Les cristaux optiquement actifs sur la lame produiront de belles couleurs.

* Le microscope à fluorescence: Contrairement aux autres modes de microscopie optique basés sur les caractéristiques des échantillons macroscopiques, tels que les gradients de phase, l'absorption de la lumière et la biréfringence, la microscopie à fluorescence est capable d'imager la distribution d'une seule espèce moléculaire émission de fluorescence. Ainsi, en utilisant la microscopie à fluorescence, la localisation précise des composants intracellulaires marqués avec des fluorophores spécifiques peut être surveillée, ainsi que leurs coefficients de diffusion associés, leurs caractéristiques de transport et leurs interactions avec d'autres biomolécules. En outre, la réponse spectaculaire de la fluorescence aux variables environnementales localisées permet d'étudier le pH, la viscosité, l'indice de réfraction, les concentrations ioniques, le potentiel de membrane et la polarité du solvant dans les cellules et les tissus vivants. Les fabricants de microscopes proposent des combinaisons de filtres propriétaires (souvent appelés cubes ou blocs) contenant une combinaison de miroirs dichroïques et de filtres capables d'exciter les chromophores fluorescents et de détourner la fluorescence secondaire résultante vers les oculaires ou le tube de l'appareil photo. Un large éventail de cubes filtrants est disponible auprès de la plupart des grands fabricants, qui produisent désormais des ensembles de filtres capables d'imager la plupart des fluorophores courants utilisés aujourd'hui. Afin de générer une intensité lumineuse d'excitation suffisante pour fournir une émission de fluorescence secondaire capable d'être détectée, des sources lumineuses puissantes sont nécessaires. Ce sont généralement des lampes à arc au mercure ou au xénon (brûleur), qui produisent un éclairage à haute intensité suffisamment puissant pour reproduire des échantillons de fluorescence faiblement visibles.
Microscope Olympus CX43 Standard, trino, LED
Ceci est un excellent microscope Zeiss à moins de 3 000 euros!

Systèmes optiques finis et infinis
À l'époque où les microscopes biologiques étaient relativement simples, avant les techniques d'épifluorescence et confocales, il était inutile d'interposer des composants optiques entre l'objectif et l'oculaire. Ces instruments avaient une lumière convergente dans l'espace intercalaire.

Les métallurgistes et les géologues ayant besoin de lumière polarisée, et avant l'invention de polariseurs minces, cela exigeait l'insertion de prismes massifs et d'autres accessoires dans cet espace. Un fabricant dans les années 1930, à court de place dans le tube standard (160mm) et aux prises avec des problèmes de correction des aberrations dus aux prismes, a proposé que les objectifs soient conçus pour projeter leurs images à l'infini et non à une distance finie.
De facon indirect, c'est une garantie de qualité, mais aussi de longévité de l'investissement puisque ce sont des microscopes évolutifs.

Ouverture numérique
En microscopie, l'ouverture numérique est une information importante car elle indique le pouvoir de résolution d'une lentille. La taille des détails les plus fins pouvant être résolus est proportionnelle à λ / 2NA, où λ est la longueur d'onde de la lumière.

Un objectif avec une ouverture numérique plus grande sera capable de visualiser des détails plus fins qu'un objectif avec une ouverture numérique plus petite. En supposant une optique de qualité (limitée par la diffraction), les lentilles présentant des ouvertures numériques plus grandes collectent plus de lumière et fournissent généralement une image plus lumineuse, mais procurent une profondeur de champ moins importante.
Mais l'augmentation de l'ouverture numérique de l'objectif réduit la distance de travail, c'est-à-dire la distance entre la lentille frontale et l'échantillon, il y a donc intérêt à avoir un diamètre de lentille le plus grand possible.

Caractéristiques de l'bjectif
Grossissement.....Numerical Aperture.....Distance de travail (mm).....Profondeur de champ (μm)
4x. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.10. . . . . . . . . . . . . . . 30.00. . . . . . . . . . . . . . . 15.5
40x. . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.65. . . . . . . . . . . . . . . 0.65. . . . . . . . . . . . . . . 1.0
100x (oil. . . . . . . . . . . . . 1.25. . . . . . . . . . . . . . . 0.18. . . . . . . . . . . . . . . 0.19
Cela implique que pour un objectif grossissant 100X donc un ensemble oculaire + objectif grossissant environ 1000 fois, il faut une molette de mise au point précise au moins à 0,01µm près. Très peu de microscopes sont capable de cette performance.
Sachant que la plupart des microscopes (hors le haut de gamme) ont un réglage fin de 2µ, la limite raisonnable pour un télescope vendu pour un grossissement de 1000 fois est plutôt de 100 fois!

Lamelles
les performances optiques du microscope dépendent de l'un des composants optiques que le concepteur de lentilles et le fabricant ne peuvent contrôler - la lamelle recouvrant l'échantillon. Les fabricants de microscopes recommandent une épaisseur de lamelle de 0,17 mm et la gravent sur le corps de l’objectif (ceci correspond à une lamelle n ° 1 1/2, en termes de fournitures de laboratoire).

De nombreux spécimens sont préparés avec des lamelles d’épaisseurs différentes. Ceci est peu important pour les observations à faibles puissances, mais cela a une forte influence à 40X et plus. En termes de concepteurs de lentilles, les lamelles non standard bouleversent l'aberration sphérique de l'objectif; en termes d'utilisateurs, l'image perd son contraste et son aspect est nuageux.

Alors que 0,65 est le ouverture numérique des objectifs 40X ordinaires, les objectifs secs les plus performants peuvent atteindre 0,95. Celles-ci sont tellement influencées par l’épaisseur de la lamelle qu’un collier de correction doit être installé sur l’objectif. La qualité d'image est optimisée en la tournant tout en observant l'apparence de l'image. Tourner le collier modifie l'espacement interne de certains composants de l'objectif, ce qui, malheureusement, change également la mise au point effective de l'objectif. En pratique, il faut simultanément tourner le collier d'une main et le bouton de mise au point fine de l'autre, tout en recherchant l'image la plus nette. De nombreux utilisateurs ne maîtrisent jamais cette technique. Pour les ouverture numérique supérieurs à 0,95, des lentilles d’immersion sont proposées.